2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。
研究内容：
第一部分：建立将力学刺激传递到骨系细胞的动物实验模型，通过动物实验验证间断力学刺激与骨形成和骨破坏之间的关系，确定本实验中拟采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。
第二部分：体外培养OB和OC，采用基因芯片法检测不同力值的间断力学刺激下OB和OC基因表达谱的时序变化。
第三部分: 利用激光捕获显微分离技术, 采集动物模型体内种植体—骨界面区域的OB和OC,再用基因芯片法检测“生理”负荷和“超”负荷下各类细胞基因表达谱的时序变化。
第四部分：采用RT-PCR方法，对骨形成和骨破坏过程中OB、OC基因表达变化差异最大的几个基因进行检测和验证。
第五部分：统计学分析比较体内外OB、OC基因表达的时序变化和差异，分析从骨形成到骨破坏过程中整个基因组表达的差异及其作用机制。
研究目标：
本研究拟通过体内外实验，探讨从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中骨系细胞基因表达的差异，从整体角度分析“生理”负荷促进骨形成和“超”负荷导致骨破坏的基因调控机制，明确相关的特异性基因表达，探讨OB和OC在力学刺激下的耦联机制，探索未知的相关调控基因或信号转导相关基因，从而为与骨生物力学相关的临床学科提供分子水平的理论基础以及临床应用的指导。
拟解决的关键问题
1）、建立动物模型，确定本实验中拟采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。
2）、通过体内体外OB和OC，在间断力学刺激下不同时间点取样的基因表达谱的比较，研究骨系细胞基因表达的时序变化。
3）、通过体内体外OB和OC基因表达谱差异的对比分析，探讨OB和OC的耦联机制。
4）、通过探索骨形成和骨破坏过程中OB和OC特异性基因表达的种类和丰度，尝试找寻相应的“标记”基因。
5）、通过基因表达谱的比较，结合基因数据库的数据，结合重要调控基因的发现，从整体角度分析负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建的机制，为进一步研究提供新的线索和思路。
3、拟采取的研究方案及可行性分析。
研究方案
一）、实验动物模型的建立及间断力学刺激对骨系细胞影响的观察
1）、选6月龄SD大鼠60只，雌雄各半，分别单侧股骨植入纯钛种植体（Ф2.0，L 8）骨外暴露4mm，以备加力用，2-3月后，X光验证骨整合者备用。
2）、随机分为5组，Zwick1454自动材料万能试验机分别以0N，5N，10N，20N，40N力值、2HZ的频率给种植体轴向加载，每天3次，每次1小时，连续3周。如种植体明显松动，停止加载，取材检测。
3）、3周后取材， 通过骨形态学计量方法分别检测各种植体周围骨质的骨小梁表面成骨细胞数、骨小梁表面破骨细胞数、有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁总表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁总表面的百分比等相关指标检测。
4）、各指标经统计学分析，确定临界负荷及本课题将采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。
二）、体外培养的成骨细胞、破骨细胞在间断力学刺激下基因表达谱的基因芯片检测
1）、体外培养成骨细胞和破骨细胞，观察不同负荷下的生物学性状。（已积累经验）
2）、将前期实验测出的标准“生理”负荷和“超”负荷换算成大气压，通过气压加压装置间断加力于体外培养的成骨细胞和破骨细胞，其力学参数参考前期实验。
3）、将“生理”负荷和“超”负荷作用于成骨细胞，以1h ,24h ，48 h，4d为取样点，未加力为对照，抽提mRNA后，逆转录标记cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。(取样时间点系根据前期实验总结、临床经验、及参考相关文献提出)
4）、将“生理”负荷和“超”负荷作用于破骨细胞，以1h ,24h ，48 h，4d 为取样点，未加力为对照，抽提mRNA后，逆转录标记cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。
三）、体内骨组织不同负荷和时间下成骨细胞和破骨细胞基因表达谱基因芯片检测
1）、90只SD大鼠动物模型，随机分为三组，每组各30只。
2）、I组：按“生理”负荷力值加载，随机选5只大鼠，分成6小组，分别在1h加载后，以及24h, 48 h，4d加载（每天3次，每次1小时）后取下大鼠股骨，分别分离种植体和骨组织，取与种植体交界处骨组织，采用激光捕获显微分离技术分别分离出成骨细胞和破骨细胞，将每小组5个样品的成骨细胞（或破骨细胞）等量混合，抽提mRNA，逆转录标记cDNA,基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞的基因表达谱（基因芯片为大鼠Oligo基因芯片，6000个cDNA的微阵列，由北京博奥生物芯片有限公司协助制备）。
3）、II组：按“超”负荷力值加载后，随机选5只大鼠，分成6小组，分别在1h加载后，以及24h，48h,6d加载（每天3次，每次1小时）后取下大鼠股骨，其余方法同I组。
4）、III组：无负荷加栽组，与上两组同期取种植体周围骨组织，抽提成骨细胞和破骨细胞mRNA，逆转录标记cDNA,基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞基因表达谱。
四）、采用RT-PCR检测不同负荷下表达差异明显的基因
拟对在骨形成和骨吸收中基因表达差异（上调或下调）超过5倍的基因，应用RT-PCR法进行基因表达水平的半定量测定，并结合基因数据库分析此生理过程中涉及功能性基因的种类和变化的幅度，以期阐明“标记”基因。
1）、样品在做基因芯片检测之前，提取部分细胞，标记，液氮冻存备用。
2）、据基因芯片检测的结果，对I、II组基因表达差异最大的数个基因通过逆转录–聚合酶链反应（RT-PCR）法，抽提细胞的总RNA，逆转录，再通过随机引物法对此类基因进行基因表达水平的半定量分析。结合基因数据库，分析这些基因的主要功能及作用。
可行性分析：
1、项目是在大量查阅国际最新相关文献资料，并结合申请者本人相关的前期工作的基础上，采用了多种学科、多种技术相结合的综合性研究方法，从而保证了立题的新颖性、科学性和可靠性。
2、本项目在技术思想上是课题“？？？”的延续和发展。在前期相关的研究中发现，在生理范围内，机械应力的增加导致与成骨相关基因表达（比如转化生长因子-β1、骨形成蛋白-4）的激活或上调，有理由相信可能存在破骨相关基因的灭活或下调（或相对水平的下调）。反之亦然。此二者对比，结合相同条件下体内外基因表达谱的异同，我们预期能筛选出与骨形成、骨破坏以及信息耦联密切相关的特异性基因，并可进一步研究其互关系。
3、项目申请者多年从事生物力学、分子生物学的相关的研究，在临床和科研上有着多年的组织和实践经验。近年先后承担省科技攻关计划市科委基金等科研项目积累了与该项目相关的工作经验，特别是将力学刺激传递到骨系细胞的动物实验模型的建立，为本项目的完成奠定了基础。
4、与课题相关的基因芯片检测技术比较成熟，课题组成员有一定的工作经验和技术，已同生物科技有限公司，生物芯片有限公司达成协议，基因芯片的制备和相关技术支持可以得到保证。
5、激光捕获显微分离技术（Laser Capture Microdissection LCM）在软组织应用以很成熟，课题组成员有在骨松质捕获细胞的经验，所需设备已具备。
4、本项目的特色与创新之处。
1）不仅从体外，还通过动物模型从体内探讨力学刺激作用下成骨细胞和破骨细胞上千个基因的动态表达。
2）首次应用基因芯片技术从整个基因组的宏观水平，探寻不同负荷状态下，骨形成和骨破坏的基因调控机制，以及成骨细胞和破骨细胞在其中的作用，及其可能的耦联机制。
3）在体内实验中采用激光捕获显微分离技术（LCM），从骨组织与人工材料界面捕获所需的成骨细胞和破骨细胞，使相关基因的检测更加准确。
4）通过本课题的研究可能引出的思考：
A）不同类型的应力，不同的作用方式和时间均有可能影响基因的表达，本课题为简化实验，突出重点，选用间断力学刺激作为力的作用形式。根据本课题所测得的特异性基因表达的结果为基础，针对不同应力形式对骨系细胞基因表达的影响是否存在差异这一尚存争论的问题，通过进一步的实验，应用聚类分析等方法，可以给出基因水平的判别。
B）、若体内实验发现的特异性基因表达是体外细胞水平实验中没有出现的，则很有可能是成骨细胞和破骨细胞耦联的作用方式，可为进一步研究两者相互作用方式提供实验基础。
C）、骨形成和骨吸收不但和应力有关，也和激素、生长因子等有密切的关系，而这是本课题没有涵盖的，这也为我们提出了以后发展的方向—结合蛋白质组学层面的研究，以期阐明骨形成、骨破坏的分子机理。